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山茱萸（Cornus officinalis Sisb. Et Zucc.）又名棗皮，是山茱萸科山茱萸的干燥果肉，具有降低血壓，抗氧化，抗癌的功效，可以補益肝腎，澀精固脫，其有效成分為馬錢苷，熊果酸等^[1]。山茱萸主要分布在陜西，河南，四川等地^[2]。

馬錢苷是一種萜苷類化合物，在調(diào)節(jié)免疫，預(yù)防心血管疾病方面具有有效作用^[3-4]。鑒于現(xiàn)行2010版《中國藥典》以馬錢苷作為含量測定指標，以控制山茱萸藥材質(zhì)量，且目前關(guān)于提取分離馬錢苷的文獻報道鮮少。制備型高效液相色譜（Pre-HPLC）作為一種高效的分離純化技術(shù)，有著分離效率高，單次分離時間短等優(yōu)點。為更深層次利用山茱萸等中藥材，控制相關(guān)藥品質(zhì)量，我們采用Pre-HPLC法，運用本實驗室裝填的動態(tài)軸向壓縮色譜柱，從中藥山茱萸中分離高純度的馬錢苷。

1  實驗方法

1.1  儀器

制備型高壓高效液相色譜柱（ID63×630mm）、動態(tài)軸向加壓液壓站：聊城萬合工業(yè)制造有限公司；制備高壓輸液泵：GLP3250；紫外—可見檢測器：UC-3292；Rheodyne3725i六通進樣閥（配5ml定量環(huán)）；色譜工作軟件及電腦。高效液相色譜儀，高速離心機，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2  試劑與試藥

二次重蒸水；甲醇，乙腈（均為工業(yè)級，使用前先經(jīng)過整流處理再用孔徑為0.45μm的微孔濾膜過濾）；薄層色譜硅膠、柱色譜硅膠、球形硅膠（富士硅化學(xué)有限公司）；大孔吸附樹脂；山茱萸藥材購自河南；馬錢苷對照品（99%含量）。

1.3樣品的處理

將山茱萸藥材粉碎，稱取粉末4kg，加入6倍量的95%乙醇浸泡24小時，回流提取2次，每次2h，濾過，合并濾液，濾液回收乙醇，減壓濃縮至無乙醇味。濃縮液用離心機以10000rpm的轉(zhuǎn)速離心3min，取上層澄清液，即為山茱萸提取液。

1.4大孔樹脂富集苷類

取大孔吸附樹脂1kg，乙醇浸泡3d，傾去上浮物，濕法裝柱。用乙醇清洗，至流出液與水混合不呈現(xiàn)白色乳濁現(xiàn)象即可，然后用大量蒸餾水清洗柱中乙醇，水浸泡備用。將1.3節(jié)山茱萸提取液吸附于大孔樹脂柱，用6000ml蒸餾水、30%乙醇約15000ml依次洗脫，將乙醇洗脫部分濃縮，浸膏備用。

1.5硅膠柱色譜純化

硅膠（100-200目）2kg,濕法裝柱，取1.4節(jié)所得浸膏與等量硅膠的拌料，上樣，柱色譜分離，用氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)以體積比15:1，12:1，9:1，6:1，3:1梯度洗脫，收集氯仿-甲醇9:1的餾分，減壓濃縮后過濾，得白色固體。

1.6高效型液相色譜純化

液相色譜制備條件：球形硅膠填料（ID63×630mm）：流動相：甲醇-水（體積比38:62）；流速：150ml/min；檢測波長：236nm。

稱取2kg硅膠加入3000ml甲醇超聲，攪拌30min脫氣，將攪拌好的硅膠緩慢注入柱體內(nèi)，沉降30min，裝好柱頭密封元件，軸向加壓壓縮柱床至出液管無液體流出。將1.5所得白色固體溶解于甲醇-水（38:62）中，抽取10-15ml經(jīng)針式濾膜過濾，舍棄初濾液，續(xù)濾液收集至潔凈容器中備用。手動進樣針進樣。收集保留時間為7.5min的組分，見圖1。收集液干燥后得白色晶體。

2  結(jié)果測定

2.1  結(jié)構(gòu)確定

馬錢苷：白色晶體，易溶于甲醇、水。¹³C-NMR（500MHz，CD₃SOCD₃）δ：168.245（11-C），150.985（3-C），112.856（4-C），97.526（1’-C），96.459（1-C），75.896(5’-C)，75.125(3’-C)，73.985(7-C)，72.563(2’-C)，69.103(4’-C)，60.142(6’-C)，51.871(12-C)，44.328(9-C)，39.523(6-C)，39.103(8-C)，29.623(5-C)，10.985(10-C)，NMR數(shù)據(jù)與文獻報道^[5]一致，結(jié)構(gòu)確定為馬錢苷。

2.2 定性測定

將所得的馬錢苷在硅膠板上點樣，馬錢苷對照品溶液作對照，氯仿—甲醇為展開劑，晾干，硫酸溶液為顯色劑，吹風(fēng)機吹干，馬錢素樣品為與對照溶液相同的紫紅色斑點，Rf值為0.52。

2.3 定量測定

將馬錢苷對照品準確稱取5mg，用甲醇配制成0.05mg/ml的溶液100ml，作為對照品溶液。

精密稱取制得的馬錢苷單體25mg，加甲醇-水鹽酸（體積比30:70）混合液25ml，轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，用微孔濾膜（0.5μm ）濾過待用。

高效液相色譜分析條件：C18（ID4.6×250mm）：流動相：甲醇-水（體積比30:70）；流速：1.0ml/min；檢測波長：236nm。在此色譜條件下，馬錢苷對照品為一個主峰，歸一化面積百分比達98%以上

3討論

現(xiàn)代研究表明，馬錢苷為山茱萸中的主要活性成分，為藥典^[2]中控制其藥材質(zhì)量以及相關(guān)中成藥質(zhì)量的指標成分。用上述制備方法進行提取、分離、純化，操作方便，重現(xiàn)性好，符合對照品的純度要求，因而可作為對照品使用。

根據(jù)山茱萸中主要活性成分—馬錢苷的理化性質(zhì)，在提取純化工藝中，采用大孔吸附樹脂精制苷類，大大提高了馬錢苷的富集量，除去大量雜質(zhì)。富集后的樣品通過硅膠柱色譜進一步分離純化，可得到馬錢苷粗品。粗品通過制備型高效液相色譜再次處理純化，從核磁共振譜圖，薄層色譜圖，分析型高效液相色譜圖，可確定樣品結(jié)構(gòu)，純度符合標準，可作為對照品。

參考文獻

[1]  中華本草. 國家中醫(yī)藥管理局中華本草編輯委員會,1999

[2]  國家藥典委員會編. 山茱萸. 中華人民共和國藥典（1部）. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2010:26

[3]  謝宗萬. 全國中草藥匯編（上冊）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,1975.

[4]  孫文基、謝世昌主編. 天然藥物成分定量分析,中國醫(yī)藥科技出版社，2003年1月，第一版

[5]  劉錚等. 化學(xué)世界. 1996,（7）：355-358

[6]  沙世炎等. 中草藥有效成分分析法